Monitoring in vivo protein-protein interactions by coupling bimolecular fluorescence complemetation (BIFC) and flow cytometry

Comunicaciones a congreso

Venda de kiwis online : www.prosmokiwi.com

Avui en dia la venda de productes, mitjançant les possibilitats que ens ofereix Internet, es troba en ple creixement. Aquest projecte pretén posar en funcionament una pàgina Web dedicada a la venda de fruita, concretament kiwis. Des de fa un temps, la població comença a ser conscient del desequilibri entre l'agent productor i l'agent comercial. Com passa també en altres sectors, el productor ven a un preu molt inferior respecte al que després es ficarà de cara al comprador final. En el cas de la fruita, el client acaba comprant un producte més car i normalment de menys qualitat. L'objectiu principal d'aquest projecte és promoure la venda online a partir d'una mercaderia de qualitat i més econòmica, aconseguint un major benefici tant per part del productor com del client.La venta de productos, utilizando las posibilidades que Internet nos ofrece, es, hoy en día, un campo en pleno auge. Este proyecto pretende poner en funcionamiento una página Web dedicada a la venta de fruta, concretamente kiwis. Desde hace un tiempo, la población empieza a ser consciente del desequilibrio existente entre los productores i los comerciantes. Como pasa también en otros sectores, los productores venden a un precio muy inferior, respecto al que se pondrá de cara al comprador final. En el caso de la fruta, el cliente acaba comprando un producto más caro y normalmente de menor calidad. El objetivo principal de este proyecto es promover la venta online a partir de una mercancía de calidad y más económica, logrando un mayor beneficio por parte del productor y también por parte del cliente.The sale of products using the benefits of Internet is today at its very peak. This project aims to put into operation a Web page to sell fruits, specifically kiwis. Nowadays, the population starts to be aware of the imbalance between producers and merchants. As in other sectors, producers are selling with a price much lower than the final price for the last buyer. In the case of the fruits, at the end, the coustomer buys a more expensive product with a lower quality. The main objective of this project is to promove the e-commerce with a high quality and cheaper products, getting a higher benefit for the producer and for the coustomer

Simplified, Enhanced Protein Purification Using an Inducible, Autoprocessing Enzyme Tag

We introduce a new method for purifying recombinant proteins expressed in bacteria using a highly specific, inducible, self-cleaving protease tag. This tag is comprised of the Vibrio cholerae MARTX toxin cysteine protease domain (CPD), an autoprocessing enzyme that cleaves exclusively after a leucine residue within the target protein-CPD junction. Importantly, V. cholerae CPD is specifically activated by inositol hexakisphosphate (InsP6), a eukaryotic-specific small molecule that is absent from the bacterial cytosol. As a result, when His6-tagged CPD is fused to the C-terminus of target proteins and expressed in Escherichia coli, the full-length fusion protein can be purified from bacterial lysates using metal ion affinity chromatography. Subsequent addition of InsP6 to the immobilized fusion protein induces CPD-mediated cleavage at the target protein-CPD junction, releasing untagged target protein into the supernatant. This method condenses affinity chromatography and fusion tag cleavage into a single step, obviating the need for exogenous protease addition to remove the fusion tag(s) and increasing the efficiency of tag separation. Furthermore, in addition to being timesaving, versatile, and inexpensive, our results indicate that the CPD purification system can enhance the expression, integrity, and solubility of intractable proteins from diverse organisms

Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins

BACKGROUND: Many enzymes of industrial interest are not in the market since they are bio-produced as bacterial inclusion bodies, believed to be biologically inert aggregates of insoluble protein. RESULTS: By using two structurally and functionally different model enzymes and two fluorescent proteins we show that physiological aggregation in bacteria might only result in a moderate loss of biological activity and that inclusion bodies can be used in reaction mixtures for efficient catalysis. CONCLUSION: This observation offers promising possibilities for the exploration of inclusion bodies as catalysts for industrial purposes, without any previous protein-refolding step

Hacia una etnografía discursiva feminista con familias migrantes

En este artículo reflexionamos en torno a las epistemologías y metodologías feministas en el contexto del proyecto Trans-Emigra, mediante una conversación coral que hemos llevado a cabo las investigadoras. El artículo se estructura a partir de la tematización que emerge de este intercambio, para abordar los retos en la realización de una etnografía discursiva feminista con familias migrantes. Focalizaremos en el análisis de las experiencias de desigualdad de los sujetos (niñas y adultos) y la corporeización de los saberes etnográficos en los espacios de dentro y fuera del hogar. Las cuestiones que se han revelado clave en esta etnografía han sido la atención y el cuidado a prácticas de investigación centradas en la relacionalidad, la reflexividad, la vulnerabilidad y la ética feministas. Estas dimensiones han repercutido en el diseño y desarrollo metodológico de Trans-Emigra, en permanente deconstrucción, con la finalidad de generar espacios y oportunidades para la formación de agencia de investigadoras y participantes, de forma dialógica. Esta etnografía ha empleado métodos visuales-artísticos y de corte biográfico-narrativo, alrededor de los cuales también hemos reflexionado colectivamente.In this article we reflect on feminist epistemologies and methodologies in the context of the Trans-Emigra project, through a choral conversation carried out by the researchers. The article is structured based on the thematization emerging from this exchange, to face the challenges of practising a feminist discursive ethnography with migrant families. We will focus on the analysis of the experiences of inequality of the subjects (children and adults) and the corporeization of the ethnographical knowledge in the spaces inside/outside home. The ethnography has revealed as crucial questions, the attentive and careful practices of research, such as feminist relationaliy, reflexivity, vulnerability and ethics. Those dimensions have an impact on the methodological design and implementation of Trans-Emigra, which has been in a permanent deconstruction, with the aim of generating spaces and opportunities for the agency formation by the researchers and participants, in a dialogical model. This ethnography has employed visual-artistic and biographic-narrative methods, around which we have also collectively reflected

Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.

Decades of work have aimed to genetically reprogram T cells for therapeutic purposes1,2 using recombinant viral vectors, which do not target transgenes to specific genomic sites3,4. The need for viral vectors has slowed down research and clinical use as their manufacturing and testing is lengthy and expensive. Genome editing brought the promise of specific and efficient insertion of large transgenes into target cells using homology-directed repair5,6. Here we developed a CRISPR-Cas9 genome-targeting system that does not require viral vectors, allowing rapid and efficient insertion of large DNA sequences (greater than one kilobase) at specific sites in the genomes of primary human T cells, while preserving cell viability and function. This permits individual or multiplexed modification of endogenous genes. First, we applied this strategy to correct a pathogenic IL2RA mutation in cells from patients with monogenic autoimmune disease, and demonstrate improved signalling function. Second, we replaced the endogenous T cell receptor (TCR) locus with a new TCR that redirected T cells to a cancer antigen. The resulting TCR-engineered T cells specifically recognized tumour antigens and mounted productive anti-tumour cell responses in vitro and in vivo. Together, these studies provide preclinical evidence that non-viral genome targeting can enable rapid and flexible experimental manipulation and therapeutic engineering of primary human immune cells

Protein reporters to study in vivo protein interactions and aggregation

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaL'objectiu dels dos primers capítols va ser l'aplicació de la tècnica "Bimolecular fluorescent protein complementation" (BIFC) per a detectar interaccions intracel·lulars proteiques de caràcter dèbil in vivo. Durant l'estudi s'ha demostrat que es pot acoblar a la citometria de flux creant una eina d'anàlisi proteòmica. D'altra banda, també es demostra que l'emissió de fluorescència depèn de la força de la interacció. A més a més, el mètode BIFC pot ser aplicat per a obtenir informació sobre la superfície d'interacció. D'altra banda, es descriu l'ús de BIFC com a mètode per a detectar compostos que bloquegen la interacció de proteïnes diana in vivo. Es demostra que la inhibició de una interacció va unida a una disminució en la fluorescència detectada. En el tercer capítol, s'ha investigat el grau de co-agregació in vivo entre dues proteïnes amb tendència a agregar (el pèptid amiloide A42 i la proteïna VP1 que constitueix la càpside viral) co-expressades en E.coli. D'altra banda, l'estructura dels agregats intracel·lulars ha estat investigada per desxifrar si les fibres amiloides i els cossos d'inclusió comparteixen característiques estructurals. Les dades obtingudes indiquen que l'agregació proteica in vivo presenta una remarcable especificitat que depèn de l'establiment d'interaccions selectives i resulta en la formació d'estructures oligomèriques i fibrilars que presenten propietats amiloides En el quart capítol, es descriu un nou mètode per a estudiar l'agregació proteica en llevat. Es basa en la fusió de la proteïna d'interès a un enzim, concretament la di-hidrofolat reductasa (DHFR). L'activitat d'aquest enzim és essencial per al llevat. D'aquesta manera, sota la presència d'un inhibidor d'aquest enzim (anomenat metotrexat), la tendència a agregar de la proteïna diana queda directament lligada a la supervivència i creixement del llevat. En altres paraules, si la proteïna agrega, la DHFR no serà funcional i el llevat serà susceptible a la presència del metotrexat en el medi. Al contrari, si la proteïna no agrega, la DHFR es trobarà soluble en el medi intracel·lular conferint resistència al llevat. Degut al fet que l'agregació està relacionada al creixement, no es necessita cap assaig funcional per a detectar-la. A més a més, l'ús d'un derivat fluorescent del metotrexat permet confirmar l'estat d'agregació o solubilitat de la proteïna diana. D'altra banda, les propietats anti-agregacionals de diferents compostos químics que s'uneixen al pèptid A42 també varen ser avaluades emprant el mètode juntament amb l'efecte de la deleció o la sobre expressió de xaperones en l'agregació de A42.The aim of the two first chapters was to test the ability of Bimolecular Fluorescence complementation (BIFC) to detect in vivo weak intracellular protein interactions. In this technique, the binding partners are fused to two fragments of a fluorescent protein, which recovers its function upon binding of the interacting proteins. In addition, the application of BIFC was able to map the regions involved in a given interaction without need of previous structural knowledge of the binding mechanism. It was also proven that the fluorescence was dependent on the strength of the interaction, in such a way that it could be used, at least qualitatively, to screen for best binding candidates. This problem was solved with the coupling of BIFC to flow cytometry (FC) providing a highly sensitive method to validate weak protein interactions and to screen and identify optimal ligands in libraries. On the other hand, we studied the application of BIFC to the detection of antagonists of protein interactions in vivo turning the strength of the inhibition being linked to the fluorescence signal. In the third chapter, we investigated the degree of in vivo co-aggregation between two self-aggregating proteins co-expressed in E.coli: A42 amyloid peptide and foot-and-mouth disease virus VP1 capsid protein fused to fluorescent proteins. Our data demonstrated that, in vivo, different classes of proteins, which became associated in aggregates, exhibited distinct molecular interactions and did not necessarily co-aggregate. Also, the presence of abundant fibrillar structures with amyloid properties connecting apparently amorphous regions was observed Overall, this study suggested the existence of evolutionary conserved adaptations in living systems towards restricting non-specific aggregation of misfolded proteins. In the fourth chapter, a general method to assess the intracellular solubility of proteins in eukaryotic background (particularly in yeast) was developed. It consisted in the application of an "aggregation reporter", in which the test protein was expressed as N-terminal fusion with the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR). Due to the fact that the aggregation state of the fused protein was linked directly to yeast cells survival in the presence of methotrexate, protein solubility was monitored in vivo without the requirement of a functional assay for the target protein. In addition, the intracellular anti-aggregational properties of two chemical compounds that bind A peptide were also evaluated together with the effect of a series of knockouts of yeast chaperones as well as the impact of the over expression of their genes

Pla de gestió dels senders ecoturístics del la zona d’interès etnològic de les Gavarres

El massís de les Gavarres és un espai que forma part del Pla d’Espais Naturals d’Interès Natural de Catalunya i es caracteritza per ser un espai molt ric en patrimoni cultural, sobretot etnològic. És per això que des de l’entitat del Consorci de les Gavarres sorgeix la proposta d’elaborar un conjunt de senders ecoturístics sobra la Zona d’Interès Etnològic de la Gavarres. L’objectiu principal és impulsar la posta en valor i crear instruments de gestió dels principals elements del patrimoni cultural que es troben presents arreu del massís de les Gavarres, a partir del disseny d’un conjunt de senders ecoturístics que, de manera respectuosa amb el medi ambient, serveixin d’instruments de dinamització i de gestió per a la conservació de l’espai i els seu elements patrimonials